马德里竞技球员名单 www.ocbqsw.com.cn 超氧物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于動、植物體內,是一種清除超氧陰離子自由基(O2·-)的酶。本項目依據SOD抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質存在下,核黃素可被光還原,被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生O2·-,可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙,后者在560nm處有最大吸收。而 SOD可清除O2·-,從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應后,反應液藍色愈深,說明酶活性愈低,反之酶活性愈高。據此可以計算出酶活性大小。

1 試劑

10.05 mol/L 磷酸緩沖液(PBS,pH 7.8

214.5 mM甲硫氨酸(Met)溶液

33 mM EDTA-Na2溶液

460 μM核黃素溶液

52.25 mM氮藍四唑(NBT)溶液

2 實驗方法

2.1 樣品前處理

稱取0.2 g樣品置于預冷的研缽中,分三次加入6 ml2 ml、2 ml、2 ml)預冷的磷酸緩沖液(pH 7.8),在冰浴上研磨成勻漿,轉入10 ml離心管中,低溫12000 r/min離心20min,上清夜即為酶粗提液。

2.2 測定方法

取試管3支,1支為測定管,另外2支為對照管,按下表依次加入各溶液:



各管混勻后,將對照管1用錫箔紙包好置于暗處,其他各管于4000 Lx 光照下準確反應20 min。反應結束后,以對照管1作為空白調零,分別測定其他各管在560 nm下的吸光度。

注:可提前配置反應混合液(以60個樣品為例):分別取Met溶液162 ml,EDTA-Na2溶液6 ml,NBT溶液6 ml,混合后充分搖勻。取2.9 ml混合液+0.02 ml酶液+0.1 ml核黃素。

2.3 計算公式

已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位(U),按下式計算活性。

其中:

SOD總活性以酶單位每克鮮重表示(U/g·FW);

SOD比活力以酶單位·每毫克蛋白表示;

Ack為照光對照管的吸光度;

AE為樣品管的吸光度;

Vt為提取酶液總體積(ml);

Vs為測定時酶液用量(ml);

W為樣品鮮重(g);

蛋白質含量單位為mg/g。