马德里竞技球员名单 www.ocbqsw.com.cn 短鏈脂肪酸具有揮發性,且基質復雜,增加了糞便中短鏈脂肪酸分析的難度。公司團隊對樣品除雜、衍生化等樣品預處理方法及分析中涉及的色譜方法、色譜柱和檢測器等進行總結,進一步優化用高效和靈敏的糞便短鏈脂肪酸分析方法。(咨詢:13811619975 15837171623微信)


由于SCFAs具有極性大,揮發性強等特點,SCFAs檢測難度大,且糞便等基質的復雜性更增加了樣品前處理難度,因此,建立快捷高效的前處理方法及靈敏度高、選擇性好的分析方法是短鏈脂肪酸定性、定量研究的關鍵。早期SCFAs定量測定主要采用滴定法,該法特異性不強,準確度差。隨著色譜技術的發展,氣相色譜法(gas chromatography,GC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)以及毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)等被廣泛用于SCFAs的測定,取得了階段性的進展。

1 樣品預處理方法

由于SCFAs具有揮發性,且糞便中含有大量的食物殘渣和腸道微生物,因此糞便預處理方法對SCFAs檢測至關重要,是制約SCFAs定性、定量研究的瓶頸之一。

1.1 物理預處理方法

過濾、超濾、離心或者樣本稀釋]等是SCFAs檢測中常用的樣品前處理方法。該方法過程快速簡便,但所得樣品仍含有較多蛋白、磷脂等雜質,易導致色譜柱污染,降低分離度,繼而影響定量的準確性。

1.2 有機溶劑萃取法

溶劑萃取法是利用化合物在2種互不相溶(或微溶)的溶劑中溶解度或分配系數的不同,使化合物在不同溶劑中轉移的方法。比較了3種不同的有機溶劑萃取效果,發現采用乙酸乙酯是最有效的樣品前處理方法,并成功檢測到大鼠糞便中的8個SCFAs。采用二乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲基叔丁醚對樣品中的SCFAs進行萃取,發現甲基叔丁醚有更好的萃取效果;三氯甲烷]、乙醚、乙醚乙腈混合溶劑均可用作SCFAs萃取溶劑。有機溶劑萃取劑的選擇范圍比較廣泛,不發生化學反應,操作簡單,但是后期存在萃取溶劑回收時SCFAs隨之逸失等問題。

1.3 超臨界萃取技術

超臨界萃取技術(supercritical fluid extraction,SFE)是最近發展起來的一種高效、安全的萃取技術。預先采用Ba2+沉淀尿液中的磷酸根和硫酸根離子,然后在富集了SCFAs的陰離子交換樹脂上用SFE技術對SCFAs進行衍生化和提取,成功建立了一種快速的樣品前處理方法,但是設備普及程度不高,限制了該方法的應用。

1.4 常壓/減壓水蒸氣蒸餾法

水蒸氣蒸餾是分離純化有機化合物的重要方法之一,尤其是分離對溫度敏感的物質,減壓水蒸氣蒸餾法是水蒸氣蒸餾法的進一步改良,均可用來提取SCFAs。糞便中SCFAs濃度較低時,水蒸氣蒸餾的回收率的RSO比減壓蒸餾高2~10倍[。但是,減壓蒸餾在應用時仍需注意SCFAs逸失導致的回收率偏低等問題。

2 SCFAs衍生化方法

衍生化主要是把難于分析檢測的物質轉化為穩定且易于分析的物質。SFCAs檢測中常需要進行柱前衍生化,主要是通過增加結構中的發色基團提高紫外檢測器等的響應,或者是通過降低其揮發性避免分析過程中SCFAs的逸失,使測定結果更加精準。

2.1 衍生化以提高穩定性

羥基、羧基、胺、硫醇、磷酸鹽等官能團在GC分析高溫環境下可能不穩定,因此需要通過某些硅基化試劑進行衍生化。在預處理過程中,應注意防止揮發性衍生物的蒸發而引起的SCFAs損失。為了避免這種情況,在SCFAs衍生化過程中通?;夠嵋肼燃姿狨?sup style="line-height:0px;word-wrap:break-word;word-break:break-all;">[。Zheng等以氯甲酸丙酯為衍生化試劑,進行樣品的預處理,測定了人類糞便、血清中的14個SCFAs,以提高方法的穩定性。

2.2 衍生化以提高靈敏度

SCFAs的衍生化提高了HPLC檢測分析的靈敏度。衍生化試劑主要有單硝基取代的硝基苯肼,以吡啶作為催化劑,水溶性的碳化二亞胺試劑作為偶聯劑,與SCFAs進行衍生化,該方法適用于衍生化含有羧酸、醛、酮等基團的化合物。]應用以上方法對SCFAs進行衍生化,提高其檢測靈敏度,成功建立了SCFAs的HPLC-DAD/MS分析方法,是一種可廣泛應用于SCFAs檢測的衍生化方法。

2.3 衍生化以提高分離度

將樣品進行簡單的酸化也是一種可用于SCFAs檢測的前處理方法,酸化劑主要包括鹽酸、磷酸、甲酸、硫酸及草酸等,酸化有利于提高SCFAs的分離度。]在氣質聯用中分別對樣品進行酸化的預處理,可以較好地防止SCFAs分析過程中產生死吸附,減少峰拖尾、肩峰現象,有利于后期的定性、定量分析處理。SCFAs的HPLC分析,主要采用高氯酸或硫酸對其進行酸化,有利于脫蛋白,同樣可起到除雜和提高分離度的作用。

3 分析方法3.1 GC法

GC法具有分離效率高,分析速度快,樣品用量少和檢測靈敏度高等優點。

1952年GC被首次用于SCFAs檢測。

3.1.1 檢測器的選擇

GC氣相色譜的檢測器有火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID)、熱導檢測器(thermal conductivity detector,TCD)、電子俘獲檢測器(electron capture detector,ECD)、火焰光度檢測器(flame photometric detector,FPD)、氮磷檢測器(nitrogen-phosphorus detector,NPD)、光離子化檢測器(photoionization detector,PID)、紅外光譜檢測器(infrared spectrum detector,IRD)和質譜檢測器(mass detector,MSD)等。FID是一種高靈敏度通用型檢測器。相關文獻表明,FID在短鏈脂肪酸定量分析方面具有優勢,是一種首選的GC檢測器。

GC-MS聯用技術具有可同時對SCFAs進行定性及定量研究的優點,應用該技術對生物樣品中的SCFAs進行分析,方法精密度及回收率等均滿足定量檢測要求,并可獲得相關化合物的結構信息,同時完成定性定量研究。

3.1.2 色譜柱的選擇

氣相色譜柱現常用毛細管柱,主要包括非極性柱(如DB-1)、弱極性柱(如DB-5)、強極性柱(如FFAP),由于SCFAs極性大,FFAP柱對于SCFAs具有很好的分離效果。一種方法是以FFAP毛細管柱對人和大鼠結腸中的SCFAs進行了測定,測定了8個SCFAs的含量,重復性與回收率等均滿足定量要求。一種方法是采用DB-FFAP毛細管柱對Beagle犬腦脊液-血漿-糞便中SCFAs進行了快速檢測,方法簡單、靈敏,從腦脊液、血漿中檢測到7個SCFAs,糞便中鑒定了8個SCFAs。另外,與FFAP色譜柱具有相同特性的毛細管柱(Econo-Cap EC-1000)也被廣泛用于SCFAs測定??杉?,基于SCFAs極性強,在開發GC分析檢測方法時,盡量選擇強極性毛細管柱,有利于獲得最佳的保留時間和分離度。

3.2 HPLC法

HPLC法檢測SCFAs具有簡便、快速等特點。由于SCFAs易揮發且分子結構中缺乏具有紫外和熒光吸收的基團,常采用柱前或柱后衍生化對SCFAs進行結構改造,用紫外或熒光檢測器進行檢測。

3.2.1 檢測器的選擇

HPLC常用檢測器有紫外檢測器(ultra violet detector,UVD)、示差折光檢測器(refractive index detector,RID)、電導檢測器(electrical conductivity detector,ELCD)、電化學檢測器(electrochemical detector,ECD)、質譜檢測器(mass detector,MSD)。

UVD是HPLC分析最常用的檢測器,檢測結果不受溫度變化、流動相組成和流速的影響。文獻等用HPLC-UV法對人類糞便中SCFAs的含量進行檢測。譚力等用HPLC-UV法測定了生物樣品(包括結腸組織、糞便、唾液、十二指腸液、尿和血漿)中的SCFAs含量,結果與GC所測得結果相似。Ferrario等采用紫外檢測器-示差折光檢測器(UV-RI)聯用技術,成功對糞便中的SCFAs進行測定,進一步擴展了方法的檢測范圍??杉?,多種檢測器聯用技術是一種有效補充紫外檢測器不足的策略。

RID通用性強,但靈敏度較低,對溫度、壓力等變化敏感,色譜柱和檢測器均需保持恒溫環境。通過模擬人體腸道消化系統環境,應用HPLC-RI對添加不同濃度的膳食纖維發酵體系進行了SCFAs含量的測定,發現兒童糞便提取物發酵體系中SCFAs水平高于成人。該檢測器用于SCFAs分析時無需對其進行衍生化,可直接檢測分析,可有效簡化樣品前處理過程,縮減分析周期。

ELCD主要用于測量無機離子和小分子有機物(有機酸和胺)。它是一種高度靈敏的檢測器,但對溫度變化非常敏感。]應用該檢測器對結腸癌患者術后腸道環境的SCFAs進行測定,發現術后腸道環境中SCFAs顯著減少。作為一種對溫度過于敏感的檢測器,在實際運用中會存在穩定性、重復性差等問題,可作為一種備用檢測器類型。

ECD以測量物質的電信號變化完成檢測,靈敏度高,可直接對無發射基團的化合物進行分析,精簡預處理過程并縮短分析時間。]應用ECD對大鼠和人類糞便中的SCFAs進行測定,SCFAs的重復性的RSD < 2.7%,回收率超過92%,證明該檢測器具有臨床和生物醫學應用潛力。

MSD是另一種通用型檢測器,靈敏度高、選擇性強,同時能提供化合物的相對分子質量和結構信息。應用MSD對人類糞便中的SCFAs進行測定,成功地開發并驗證了用衍生化試劑和UPLC/MRM-MS進行化學衍生物的分析方法,精確地測定了10個SCFAs。Meesters等[59]應用MSD對豬血清中的SCFAs進行測定,為研究其他器官中的SCFAs奠定了基礎。

3.2.2 色譜柱的選擇

在反相高效液相色譜法(reversed-phase high performance chromatography,RP-HPLC)檢測中,以C18硅膠為填料的色譜柱最為常用。用YMC-Pack FA色譜柱在人類糞便中檢測8個SCFAs。用YMC-Pack ODS-AQ色譜柱,分析了7個SCFAs。用YMC-Pack Pro C18色譜柱對小鼠糞便中SCFAs進行測定,該色譜柱與傳統ODS柱相比,在傳統ODS柱基礎上采用更高純度硅膠基質及更先進端基封尾技術,耐用性和重現性更佳,對化合物具有更好的分離效果。

離子色譜柱是以低交換容量的離子交換樹脂為固定相對離子性物質進行分離,用ELCD連續檢測流出物電導變化的一種色譜方法。有3種分離方式,它們是高效離子交換色譜(high performance ion exchange chromatography,HPIC)、離子排斥色譜(high performance ion exclusion chromatography,HPIEC)和離子對色譜(ion-pair chromatography,PIC)。]用Aminex HPX-87H離子交換色譜柱,對SCFAs的含量進行測定。Ferrario等用離子交換色譜柱對SCFAs進行測定,研究益生菌對微生物群及SCFAs水平的影響,發現糞便中丁酸水平是一種重要的生物標志物,可用于鑒別益生菌對受試者的治療效果。Valerio等用離子排斥色譜柱對人類糞便中的SCFAs進行測定,確定5個SCFAs的定量限。宗艷平等采用離子交換色譜柱和離子排斥色譜柱聯用法對琥珀酸進行測定,方法重復性好、準確度高、專屬性和耐用性強。RP-HPLC與離子排斥色譜柱聯用時檢測范圍大,分離度好,也是一種具有開發優勢SCFAs液相色譜分析方法。

3.3 高效毛細管電泳法

高效毛細管電泳法(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是一類以毛細管為分離通道,以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。HPCE與GC和HPLC相比,具有快速、簡便,所需樣品量少和反應條件溫和等優點,適用于SCFAs常規分析。

UVD、激光誘導熒光檢測器(laser induce fluorescence detector,LIF)、ECD)和MSD均可用與CE聯用對SCFAs進行檢測,其中以UVD應用最廣。間接和直接毛細管電泳-紫外檢測法(CE-UV法)都曾被用來測定SCFAs,其中間接CE-UV法因可對SCFAs進行快速有效地分離而被廣泛應用。

通常CE-UV用于SCFAs檢測時分離度較好,但該方法靈敏度較低;毛細管電泳-激光誘導熒光法(CE-LIF法)提高了靈敏度,但分離范圍窄,這是因熒光試劑的質量大和熒光衍生化試劑的反應活性等問題引起的。因此,尋找出最佳衍生化試劑是進行CE-LIF分析的一個難點。

4 展望

SCFAs作為腸道內碳水化合物的細菌發酵產物,既可以調節腸道微生物菌群多樣性,使腸道微生態系統處于良好的狀態,還可以預防腫瘤的發生,抑制腫瘤細胞的增殖等生物活性,所以實現對SCFAs的定性和定量是腸道菌與健康相關性研究的關鍵。

隨著科技發展和研究的深入,糞便中SCFAs分析在樣品前處理和分析方法方面仍有許多提升的空間。

4.1 樣品前處理技術

當前還有幾個有望用于糞便中SCFAs分析的樣品前處理技術。

4.1.1 固相萃取技術

固相萃取是一種常用的生物樣品預處理技術,主要用于生物樣品中化合物的分離、純化和濃縮。特別是固相微萃取技術,是一種更快速、更有選擇性、更靈敏的技術。與傳統的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率,更有效地將分析物與干擾組分分離,減少樣品預處理過程,操作簡單、省時、省力,是一種有望用于SCFAs的提取、富集方法。

4.1.2 液相微萃取技術

液相微萃取是近年來發展起來的一種新型的樣品前處理技術,該技術集采樣、萃取和濃縮于一體,需要有機溶劑量非常少,是一種環保的萃取技術。目前,該技術主要與GC或GC-MS、HPLC和CE聯用,用于一些難揮發和半揮發的環境污染物以及生物樣品中低濃度藥物的分析,因此,有望開發相關前處理方法用于SCFAs的提取和富集。

4.1.3 吹掃捕集技術

吹掃捕集技術從理論上講,是動態頂空技術,是用流動氣體將樣品中的揮發性成分”吹掃”出來,再用捕集器將吹掃出來的有機物吸附,隨后經熱解吸將樣品送入GC儀進行分析的技術。該技術無需使用有機溶劑,對環境不造成二次污染,而且具有取樣量少,富集效率高,受基體干擾小及容易實現在線檢測等優點。吹掃捕集樣品預處理技術與GC-MS聯用已用于糞便樣品分析,應用該方法有望實現糞便中SCFAs在線監測。

4.2 色譜分析方法

GC是目前應用最多的SCFAs檢測方法,HPLC和CE雖然具有分析條件溫和,準確度高等優點,但檢測條件受檢測器制約,存在各種局限。GC、HPLC及CE與MS檢測器聯用,可同時獲得定性、定量數據,特別是在分析復雜生物樣品時,MS的高靈敏度和選擇性使其成為首選檢測器。隨著分析儀器的發展,在線分離和多儀器聯用特別是多維色-質譜聯用技術將進一步發展,有望為SCFAs研究提供技術保障。